ssDNA/RNA環(huán)化連接酶
- 別名：ssDNA/RNA 環(huán)化連接酶,CircLigase
- 編碼：ECE1187A
- 級(jí)別：
- 簡(jiǎn)介：ssDNA/RNA 環(huán)化連接酶，也稱為 CircLigase,通常是通過(guò)基因工程技術(shù)在特定的宿主細(xì)胞中表達(dá)生產(chǎn)得到的重組酶。
基礎(chǔ)信息
| 中文名 | ssDNA/RNA環(huán)化連接酶 |
產(chǎn)品介紹
基本信息
名稱：ssDNA/RNA 環(huán)化連接酶，也稱為 CircLigase。
來(lái)源：通常是通過(guò)基因工程技術(shù)在特定的宿主細(xì)胞中表達(dá)生產(chǎn)得到的重組酶。
規(guī)格：常見的有 2000U、20KU 等不同規(guī)格。
酶的特性
熱穩(wěn)定性：為熱穩(wěn)定的 DNA/RNA 連接酶，能在較高溫度下保持活性。
作用方式：不依賴于 ATP，可催化單鏈 DNA 或單鏈 RNA 的分子內(nèi)環(huán)化。但澤葉生物的產(chǎn)品可催化分子間連接，對(duì)單鏈 DNA 的連接效率更高。
底物要求：要求催化底物單鏈 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基團(tuán)和 3’-OH 基團(tuán)。對(duì)于大于 15nt 的單鏈底物，能高效連接。
活性定義：65°C 1h 條件下，催化 1pmol 5’- 磷酸化的 ssDNA 底物環(huán)化，所需的酶量定義為 1Unit
反應(yīng)條件
反應(yīng)液配制：通常包含 CircLigase、5’磷酸化 ssDNA/RNA、10×CircLigase Buffer 以及適量的 ddH?O。上海撫生實(shí)業(yè)的產(chǎn)品還提到有時(shí)需加入 50mM MnCl?。
反應(yīng)溫度和時(shí)間：一般為 65°C 孵育 1h 進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。
終止反應(yīng)：反應(yīng)結(jié)束后，可加入終濃度 10mM EDTA 終止反應(yīng)，也可采用加熱方式 85℃ 10min 加熱失活。
使用注意事項(xiàng)
環(huán)化底物 ssDNA 或 RNA 必須帶有 5’磷酸基團(tuán)，3’端含有 OH。
環(huán)化體系中的 ATP 濃度高于 20μM 以上時(shí)會(huì)極大抑制環(huán)化效率，甚至導(dǎo)致環(huán)化失敗，建議底物為純化產(chǎn)物。
由于酶具有耐熱性，在 65℃條件下進(jìn)行連接反應(yīng)，測(cè)試中 Betain 無(wú)益于連接效率提升（澤葉生物的產(chǎn)品對(duì)于含有二級(jí)或復(fù)雜結(jié)構(gòu)的連接底物，可加入 0.4 - 0.8M Betain 以提高連接效率）。
該酶主要進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化連接（澤葉生物的產(chǎn)品可催化分子間連接），分子間的連接通常未檢測(cè)到。
酶對(duì) ssDNA 和 RNA 的環(huán)化效率高，多數(shù)情況下，90% 以上的底物被環(huán)化。未被環(huán)化的 ssDNA 可通過(guò)加入 5U 的 Exonuclease I，37°C 消化 15min 去除，以獲得高純度的環(huán)化 ssDNA。
酶可以連接 15nt 以上的核苷酸，更長(zhǎng)的產(chǎn)物連接參數(shù)可能需要進(jìn)一步測(cè)試。
在小體系實(shí)驗(yàn)時(shí)注意體系的蒸發(fā)，可加入礦物油以防止蒸發(fā)。
質(zhì)量指標(biāo)
MSDS
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